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Toxin代北京试剂
产品时间：2024-02-20
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1.2 方法
1.2.1 黄连水提液的制备
称取干燥黄连 10 g，超微粉碎，加入 200 mL 的超纯水，浸泡 2 h，大火煎
至煮沸后文火，保持 30 min，纱布过滤；药渣加温水 300 mL，再大火煎至煮沸
后文火煎 30 min，过滤，合并滤液，45℃旋转蒸发仪浓缩至 500 mL，10000 rpm
离心 15 min，离心取上清，定容至 100 mL，浓缩浓度为 100 mg·mL-1，用 0.22 μm
的除菌器过滤除菌，分装 4℃冰箱保存。
1.2.2 高效液相色谱检测黄连品质
（1）色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18（150 mm×4·6 mm，5 μm）；以乙腈—0.05 mol·L-1
磷酸二氢钾溶液（50:50）（每 100 mL 中加十二垸基硫酸钠 0.4 g，再以磷酸调节
pH 值为 4.0）为流动相；检测波长为 345 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。
（2）标准曲线
分别称表小檗碱 0.0018 g，黄连碱 0.0037 g，巴马汀 0.0024 g，盐酸小碱
0.002 g，置于 100 mL 容量瓶中，用流动相定容，得表小檗碱浓度为 18 μg·mL-1，
黄连碱浓度为 37 μg·mL-1，巴马汀浓度为 24 μg·mL-1，盐酸小碱浓度为 20
μg·mL-1 的混合标准品母液。再分别稀释得到 7 个梯度的系列对照品溶液，进高
效液相色谱仪测定，最后以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标做四种物质的标准曲
线。
（3）供试品溶液制备
水煮法制得黄连生药浓度为 0.1 g·mL-1 的黄连溶液，再将该溶液在 12000 rpm
转速下离心 20 min 除去不溶性杂质，之后取上清液 1 mL 于 10 mL 容量瓶用流动
相定容，再次用 12000 rpm 离心 15 min 除去不溶于流动相的杂质，最后用 0.22 μm
有机系滤膜过滤既得供试品溶液。
1.2.3 细菌培养
（1）细菌培养 将菌株置于 TSB 液体培养液中，37℃，130 rpm 恒温培养振
荡器中培养，待细菌长至对数生长期时进行试验。
（2）细菌传代 将长至对数期的细菌，2000 rpm 离心 3 min，弃上清，用 PBS
洗一次，离心，加入适量新鲜细菌培养液，重悬以适当比例传代接种到 50 mL
新鲜培养基中，恒温培养振荡器中继续培养。
（3）细菌冻存 将对数生长期的细菌，2000 rpm 离心 3 min，弃上清，用
PBS 洗一次，离心，新鲜的培养液悬浮，加等体积已备好的甘油水溶液，分装于
1.5 mL 离心管中，标明细菌株种类和冻存日期，置于-20℃冰箱中保存。
（4）细菌复苏 从-20℃里取出冻存菌种，待其解冻，用接种环挑一环至已15
备好的固体培养基中，四区划线后放于 37℃，5% CO2 培养箱内培养，待其长出
单菌落，用接种环挑取一个单菌落至新鲜培养基中进行活化。
1.2.4 MIC 的检测
（1）菌液的准备 将冻存的痢疾杆菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基进行复
苏，待其有单菌落长出，接种于已备好的新鲜、无菌胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）
培养基中进行活化，待其培养至对数期，用 TSB 液体培养基将痢疾杆菌浓度调
节至 105-106 cfu·mL-1。
（2）样品准备 配适当体积的固体培养基高压灭菌后加入一定体积的黄连水
提液，然后半倍稀释，使其含药培养基的浓度为 0、1.25、2.5、5、10、20 mg·mL-1，
倒入以备好的无菌平板中，每个平板中 5 mL 为宜，待其冷却凝固之后，分别接
上以备好的菌悬液 50 μL 用涂菌器涂抹均匀，在 37℃的培养箱下进行培养。
（3）样品检测 细菌检测 24 h 后，观察平板上菌种的生长情况，以培养基
上无菌生长的低浓度为黄连水提液的最小抑菌浓度。
1.2.5 痢疾杆菌生长曲线
（1）药物处理 将培养至对数期的痢疾杆菌接种到新鲜培养基中，使培养液
中黄连水提液的终浓度为 2.5 mg·mL-1，5 mg·mL-1，10 mg·mL-1，无菌水为空白
对照组，37℃，130 rpm 摇床培养；
（2）准备样品 每隔 1 h 取各组样品 2 mL，连续取 24 h；
（3）检测样品 用分光光度计测定在波长为 600 的各组吸光度 OD 值，取 3
次重复实验的平均值。绘制黄连水提液作用后痢疾杆菌的生长曲线（OD 值为纵
坐标，时间为横坐标）。
1.2.6 培养液中 DNA、RNA 等大分子物质的测定
（1）药物处理 将培养至对数期的痢疾杆菌接种到新鲜培养基中，使培养液
中黄连水提液的终浓度为 2.5 mg·mL-1，5mg·mL-1，10mg·mL-1，无菌水为空白对
照组，37℃，130 rpm 摇床培养；
（2）样品准备 连续 12 h 取各组样品 2 mL，离心 10 min，4000 rpm，弃沉
淀留上清。
（3）检测样品 用紫外分光光度计测定上清液中 DNA、RNA 等大分子物质
的吸光度值，波长 260 nm。以无菌水为对照组，取 3 次重复实验的平均值。
1.2.7 黄连对痢疾杆菌细胞壁的影响
将培养至对数期的痢疾杆菌加入到含 2.5 mg·mL-1，5 mg·mL-1，10 mg·mL-1
黄连的 TSB 液体培养基中，使培养基含菌体 107 cfu·mL-1，于 37℃、130 rpm 摇
床培养，以无菌作为对照组，分别在 0、2、4、6、8、10 和 12 h 定时取样 5000 rpm，16
10 min 离心取上清，上清液按照表 1 加入 96 孔板中。
用酶标仪测定 96 孔板中各样品在 520 nm 时的吸光度，并随时间延长检测各
时间点的吸光度变化情况，平行测定 3 次取平均值。按照公式计算 AKP 的含量
（碱性磷酸酶（金氏单位/100 mL）=[（测定孔-空白孔）/（标准空-空白孔）]×
酚标准品浓度（0.02 mg·mL-1）×100 mL）
1.2.8 黄连对痢疾杆菌呼吸代谢系统的影响
（1）黄连处理 将培养至对数期的痢疾杆菌接种到新鲜培养基中，使培养液
中黄连的终浓度为 2.5 mg·mL-1，5 mg·mL-1，10 mg·mL-1，无菌水为空白对照组，
37℃，130 rpm 摇床培养 10 h，每组设置三个平行；
（2）准备样品 将培养的菌液 5000 rpm 离心 10 min，弃去上清液，
（3）处理样品 用 0.1 mol·L Tris-HCl（pH7.4）缓冲液洗菌沉淀 2-3 次后，
加入等体积的溶菌溶液，37℃水浴 20 min 后，立即冰浴，再加入 Tris-SDS
（pH=9.0）缓冲液 1 mL，10000 rpm 低温离心 15 min，取出上清液；
（4）检测样品 酶活性的测定按试剂盒说明书操作。蛋白定量方法参照
Bradford 法
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