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因此，我们重点研究了 AT101诱导的 BNIP3在 MPNST 细胞中的功能作用。为了确定 BNIP3是否促进 AT101诱导的 MPNST 细胞死亡，我们通过用 BNIP3siRNA 或对照非靶向 siRNA 转染 T265-2c 细胞来瞬时敲低 BNIP3表达。我们发现 BNIP3，而不是对照，siRNA 有效地减弱 BNIP3的表达(图3D)。然后，我们用10或15μMAT101处理 T265-2c 细胞，并比较 BNIP3siRNA 转染的细胞中的细胞活力与用对照寡核苷酸转染的细胞中的细胞活力。我们发现，与用非靶向 siRNA 转染的细胞相比，在 BNIP3敲低的细胞中，AT101诱导的细胞死亡显着减弱(图3E)。我们得出结论，BNIP3是 AT101诱导的 MPNST 细胞毒性的重要介质。 AT101引起 HIF-1α 蛋白的积累，其调节 BNIP3表达 BNIP3是 HIF-1α 的直接转录靶标，已显示调节 BNIP3表达以响应缺氧[40]和神经酰胺处理的神经胶质瘤细胞[41]。HIF-1α 可以在缺氧条件下和其他非缺氧刺激后积累[42]。AT101或棉酚处理对 HIF-1α 蛋白水平的积累尚未见报道。因此，我们检测了 AT101处理的 MPNST 细胞中 HIF-1α 的蛋白水平。我们发现 AT101处理增加了 T265-2c 细胞中 HIF-1α 蛋白的水平(图4A) ，而没有伴随的 HIF-1α mRNA 的增加(图4B)。我们还发现，在 AT101处理后，HIF-1α 蛋白在细胞核内积累(图4C) ，在那里它被证明具有转录因子的功能。来确定是否
BNIP3是 HIF-1α 的直接转录靶标，已显示其调节缺氧反应中的 BNIP3表达[40]和用神经酰胺处理的胶质瘤细胞[41]。HIF-1α 可以在缺氧条件下和其他非缺氧刺激后积累[42]。AT101或棉酚处理对 HIF-1α 蛋白水平的积累尚未见报道。因此，我们检测了 AT101处理的 MPNST 细胞中 HIF-1α 的蛋白水平。我们发现 AT101处理增加了 T265-2c 细胞中 HIF-1α 蛋白的水平(图4A) ，而没有伴随的 HIF-1α mRNA 的增加(图4B)。我们还发现，在 AT101处理后，HIF-1α 蛋白在细胞核内积累(图4C) ，在那里它被证明具有转录因子的功能。为了确定 HIF-1α 是否转录调节 BNIP3表达，我们瞬时敲低了 T265-2c 细胞中的 HIF-1α 表达(图4D) ，并检查了 AT101处理后对 BNIP3表达的影响。我们发现 HIF-1αsiRNA 而不是对照 siRNA 抑制 AT101处理的细胞中 BNIP3的表达(图4E)。我们的结论是，AT101导致 HIF-1α 蛋白在 MPNST 细胞中的积累，从而促进 BNIP3的表达。
图4。AT101通过 HIF-1α 积累刺激 BNIP3表达。用 AT101处理的 T265-2c 细胞(10μM，24小时)表现出 HIF-1α 蛋白水平增加(A) ，但是 AT101处理的 MPNST 细胞相对于未处理的细胞不显示 HIF-1αmRNA 水平(B)的显着变化。AT101导致 T265-2c 细胞核部分 HIF-1α 蛋白水平升高(C)。相对于用非靶 siRNA 转染的细胞，用 AT101处理后，用 HIF-1αsiRNA 转染的 T265-2c 细胞显示 HIF-1α 蛋白(D)和 BNIP3蛋白表达(E)的水平降低。# = 不重要。
AT101通过细胞内铁螯合作用引起 HIF-1α 的积累除了缺氧之外，某些非缺氧刺激如雌激素、胰岛素和表皮生长因子[43]-[45]可以在常氧条件下诱导 HIF-1α 的表达。有趣的是，槲皮素和高良姜素等多酚也可以诱导 HIF-1α 蛋白的积累，而不增加 HIF1-α mRNA 水平[46] ，正如我们在 AT101中观察到的。这种作用被认为是通过细胞内铁螯合作用介导的[46] ，[47]。因此，我们接下来询问铁是否参与 AT101诱导的 HIF-1α 积累，BNIP3表达和 MPNST 细胞死亡。为了解决 AT101是否干扰细胞内铁水平，我们评估了用 AT101处理的 MPNST 细胞中运铁蛋白受器1(TfR1)和铁蛋白(重链)的蛋白质水平。TfR1是一种载体蛋白，促进铁转运进入细胞[48]。TfR1的表达在转录后受到调控，并与细胞内铁浓度呈负相关。此外，铁蛋白重链催化细胞内铁储存的第一步，其蛋白质水平对应于细胞内铁水平[48]。我们发现 AT101处理增加了 T265-2c 和90-8细胞中的 TfR1蛋白水平并降低了铁蛋白重链蛋白水平，并且当培养基补充柠檬酸铁(100μM)作为铁离子的来源时，这些 AT101效应被阻断(图5A)。为了确定铁螯合是否是 AT101诱导 HIF-1α 积累以及随后的 BNIP3和自噬的机制，我们评估了补铁对这些事件的影响。在细胞培养基中加入柠檬酸铁消除了由 AT101诱导的 HIF-1α，BNIP3和 LC3II 的积累(图5B)。为了进一步评估补铁对 AT101诱导的 MPNST 细胞毒性的功能相关性，我们评估了添加柠檬酸铁后的细胞活力。
我们发现细胞培养基的铁补充对 T265-2c 和90-8细胞中 AT101诱导的细胞毒性提供了显著的保护(图5C，D)。AT101对 MPNST 细胞的这些作用与 DFO (一种著名的铁螯合剂)的作用相似。向细胞培养基中添加柠檬酸铁不能影响 ABT737的细胞毒作用，ABT737是 T265-2c 和90-8细胞上结构上不同的 BH3模拟物(图5E，F)。
图5。补铁保护 MPNST 细胞免受 AT101诱导的细胞毒性。 AT101(15μM，24小时)处理增加了 MPNST 细胞中的运铁蛋白受器1(TfR1)蛋白水平并降低了铁蛋白水平(A) ，这通过向培养基中加入柠檬酸铁逆转。补充柠檬酸铁(100μM)的培养基也消除了在 T265-2c 和90-8细胞(C，D)中 AT101诱导的 HIF-1α，BNIP3和 LC3II 蛋白表达(B)和细胞毒性。通过用柠檬酸铁(100μM)(E，F)补充培养基，MPNST 细胞不能从 ABT737(15μM)诱导的细胞毒性中拯救。DFO (50μM，24小时)作为铁螯合阳性对照。* p-value < 0.05.# = 不重要。
讨论 AT101是棉酚的修饰对映体，一种天然存在的抗凋亡 BCL-2蛋白的小分子拮抗剂[49] ，[50]。AT101及其母体化合物棉酚已被证明在广泛的癌细胞中具有细胞毒性作用，AT101目前正在进行几种癌症的 II 期临床试验[51]-[54]。除了通过计算机辅助分子建模，核磁共振成像和荧光偏振测定被鉴定为 BH3模拟物外，其他研究已经证明棉酚可以抑制 DNA 合成[19] ，细胞能量代谢[55] ，蛋白激酶C [21] ，端粒酶[57]和人类有丝分裂驱动蛋白，EG5[58]。除了这些作用之外，棉酚还可以调节钙稳态[20]和 TGF-β1信号传导[59]。在结构研究表明棉酚是一种 BH3模拟物后，发现棉酚可以通过增加活性氧类，激活 p53[61]和抑制 NF-κB 活性来激活内在的凋亡途径[62]。此外，棉酚可以增加促凋亡 BH3-only 蛋白的表达[23] ，并诱导 BCL-2中的构象改变，使其促凋亡[63]。由于棉酚细胞毒作用的机制可能受到癌细胞和其他肿瘤特异性因素的遗传特征的影响，鉴定 AT101细胞毒作用的相关机制对于评估其在 MPNST 治疗中的潜在用途是重要的。
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