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北京华新康信也有transnetyx实验试剂销售，对transnetyx组织常见问题做了解答如下：

家/Transnetyx 组织常见问题解答 | Transnetyx 组织

Soussou WV, Yoon GJ, Brinton RD, Berger TW (2007) 在表面处理的多电极阵列上培养的海马神经元的神经元网络形态和电生理学。IEEE 跨生物医学工程。54:1309-1320。 下午：17605362

Brewer GJ, Cotman CW (1989) 海马神经元在低密度限定培养基中的存活和生长：夹心培养技术或低氧的优势。大脑研究 494：65-74。下午：2765923。

预涂层 PDL 培养皿

1.你能推荐任何品牌的预涂层组织培养瓶或制备组织培养瓶用于原代神经元生长的方法吗？

Transnetyx已经确定，细胞培养塑料或玻璃上的聚-D-赖氨酸涂层在涂层后明显开始失去效力。镀膜玻璃条在 14 天后失效，镀膜塑料在 10 天后失效。 Transnetyx怀疑一些预涂板的效果令人满意，但Transnetyx的经验是，其中一些会导致原代神经元的粘附和存活不良。因此，Transnetyx建议您在一周内或上述几天后涂抹您自己的基材并使用它们。

2.你们销售预涂层培养皿吗？

是的，Transnetyx销售 PDL 涂层烧瓶、孔板和玻片。Transnetyx在一夜之间涂上这些涂层，并在第二天将它们运送到隔夜交货。Transnetyx建议您在一周内使用这些。 

新鲜纸巾

1.你们提供什么年龄的纸巾？ 

Transnetyx的标准组织是胚胎第 18 天或怀孕妈妈（3-4 个月大）的成人组织。所有其他组织年龄可用于特殊订单，交货时间为 2-3 周。

Wolburg H, Neuhaus J, Kniesel U, Krauss B, Schmid EM, Ocalan M, Farrell C, Risau W (1994) 调节血脑屏障内皮细胞的紧密连接结构。组织培养、第二信使和共培养的星形胶质细胞的影响。J 细胞科学 107（第 5 部分）：1347-1357。 下午：1692329 

Risau W, Engelhardt B, Wekerle H (1990) 血脑屏障的免疫功能：不完整的表现

体外大鼠脑微血管内皮的蛋白质（自身）抗原。细胞生物学杂志 110:1757-1766。 PM:7929640 有关从脊髓分离运动神经元的更多信息 M. Das、JW Rumsey、N. Bhargava、M. Stancescu 和 JJ Hickman。确定的长期体外神经肌肉接头组织工程模型。生物材料 31 (18):4880-4888, 2010.  PM:20346499

2.你保证每瓶皮层和海马有多少神经元？

保证的神经元数量为海马体 100 万个或皮层神经元 200 万个。其他组织类型的数字不同。

3 . 根据 NIH 批准的协议获得动物大脑和脊髓组织有什么保证？

Transnetyx的动物协议 #233-08-013 已于 2020 年 4 月 7 日获得南伊利诺伊大学医学院实验动物护理和使用委员会的批准。  

对于 NIH 拨款，脊椎动物部分：

保证编号为 A-3209-01。

F. 脊椎动物

用于原代培养的海马、皮质和其他脑和脊髓神经元将从胚胎或出生后早期大鼠或小鼠的脑中获得。用氟烷麻醉后将解剖大脑。将用于大鼠的心脏。小鼠将在麻醉下被送上断头台或断颈。这些方法与美国兽医协会专家组的建议一致。

通过从动物身上分离神经元，可以研究比整个动物研究更多的实验变量，从而减少对动物的需求。大鼠和小鼠的大脑是所有动物大脑中研究得好的。

平均住房需求估计为 2 天，足以让啮齿动物从运输创伤中恢复。动物将由获得 AALAC 认证的 SIUSM 实验室动物医学中心负责照料，并在获得 DACLAM 认证的 Helen Valentine、DVM、MS 的指导下拥有 10 名员工

用氟烷麻醉后将解剖大脑。将用于大鼠的心脏。小鼠将在麻醉下被送上断头台或断颈。这些方法与美国兽医协会专家组的建议一致。因此，这些程序将动物的使用限制在进行具有科学价值的研究中不可避免的范围内，并将动物的不适、痛苦和疼痛降至低。

 冷冻细胞

1.你们提供冷冻细胞系吗？

目前，Transnetyx不提供冷冻细胞，也没有冷冻细胞的方案。您可以请求快速冻结作为自定义选项，但需要支付额外的处理费。

解离

2.海马或皮层细胞的活力是否取决于解离的方法？你更喜欢机械解离还是酶解？

是的，使用木瓜蛋白酶可获得更高的可行产量（参见 J Neurosci Meth 71:143），但表面蛋白的消化是不可避免的。对于短期（少于 4 天），这是一个问题。从长远来看，它可能并不重要。使用火抛光的 9 英寸玻璃移液管可获得更高的存活率，使用蓝色塑料移液管可获得更低的能见度。对于 E18 组织，Transnetyx使用机械来提高速度和简单性。

3.您是否使用酶来制备皮质培养物？

为了获得更高的产量，Transnetyx使用了 2mg/mL 的 木瓜蛋白酶溶液， 稀释在没有 B27® 的 Hibernate® E-Ca 中。该溶液应在 30 o C 水浴中孵育 10 分钟。不应向该溶液中添加其他化学物质，例如 EDTA、巯基乙醇或半胱氨酸-HCl。请参阅Transnetyx的 原代神经元细胞培养方案 了解更多信息。

4.为什么推荐 Hibernate® E-Ca without B27® 以实现与木瓜蛋白酶的最佳解离？

钙促进粘附。因此，去除钙会促进神经元的解离。为了提供细胞粘附蛋白作为木瓜蛋白酶的主要底物，B27® 被省略，因此 B27® 中的蛋白质不会竞争底物。

文化

1. 原代细胞会增殖吗？如果有，你能传代多少次？

原代细胞不会增殖，不应传代。如果传代，只有 30% 的细胞存活，细胞不能进行第二次传代。

2.你知道每瓶组织提供多少星形胶质细胞吗？

星形胶质细胞的数量是细胞数量的 20%。培养神经元培养物时，使用不含血清 (NbActiv1™) 的培养基培养星形胶质细胞含量低于 2% 的培养物。这在没有 AraC 的情况下抑制了胶质细胞的生长。在培养星形胶质细胞时，可使用含有血清（NbAstro™ - Neurobasal®/Horse Serum/GlutaMAX™）的培养基在 1.5 至 2 周内使星形胶质细胞汇合。

3.我应该何时添加 AraC 作为星形胶质细胞的有丝分裂抑制剂？

在Transnetyx推荐的 Neurobasal®/B27®/GlutaMAX™ 培养基中，您根本不需要添加 AraC。培养基不会像血清那样人为地刺激星形胶质细胞的增殖。

4.星形胶质细胞会增殖吗？如果有，它们可以传代多少次？ 

星形胶质细胞确实增殖并且可以传代。Transnetyx的 E18 星形胶质细胞最多可成功传代 4-5 次。

5.海马神经元何时表现出兴奋性毒性？

乙酰胆碱在Transnetyx所知道的任何年龄都没有毒性。

从 E18 海马培养 7 天开始，谷氨酸的毒性最大。皮层神经元可能提前 1 或 2 天。

6.我的培养物被污染了。一开始它们看起来很好，但现在介质是混浊和黄色的，有许多 1-3 um 长的暗相。

至少有 5 种可能的污染源（假设您的培养箱中的其他培养物没有受到污染并且培养箱底部的加湿水是清澈的）：

培养容器本身可能是污染源。为了排除这种情况，将新鲜过滤的培养基添加到另一个培养容器中。如果介质变黄或混浊，则容器已被污染。

粘合基材。这很常见。您可以将新鲜过滤的培养基放在准备好的基材上，以寻找这种污染源。

培养基本身或其添加剂之一（例如谷氨酸）。这很常见。请务必在您的培养基的未涂层孔和Transnetyx提供的孔中进行单独的测试。

看似随机或低水平的污染可能来自于向开放文化的方向说话甚至呼吸。此外，无菌罩和培养箱之间的空气不是无菌的，并且大多数培养容器没有密封。如果从通风罩到培养箱的距离很远，您可以将培养物放入已用 70% 乙醇冲洗过的塑料食品容器中。

组织。虽然Transnetyx对Transnetyx提供的培养基进行无菌测试，但组织本身无法测试。如果您能提供证据证明您的纸巾按时送达并在 4 o  C 下保存直到使用，并且排除了上述 4 种可能性，请致电Transnetyx进行一次性更换。通常，Transnetyx的经验是，您的样品是Transnetyx本周所有发货中被污染的样品，因此请理解Transnetyx需要进行上述测试。

7.我想知道你能否给我建议，我需要多少个细胞，才能获得足够的蛋白质来进行几次蛋白质印迹？即，多少个细胞等于 20-50 ug 蛋白质？

根据 Patel 和 Brewer (2003) 的说法，每 18,000 个培养一周的细胞含有大约 6 ug 的蛋白质。因此，3000 个细胞/ug 蛋白质。需要大约 50 g 蛋白质的蛋白质印迹提取物需要大约 150,000 个细胞。

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