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Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

 Catalog No. K1018

用于细胞增殖和细胞毒性试验

Description

我们的产品Cell Counting Kit-8（CCK-8）相比以前的方法为细胞数测定和细胞增殖/毒性检测提供了更方便和灵敏的方法。试剂盒使用了一种高水溶性的四唑盐，WST-8，它在电子耦合试剂存在下还原产生水溶性formazan形式的染料。由脱氢酶产生的formazan的量与活细胞的数量呈直接的线性关系。CCK-8的检测灵敏度高于其他方法，如MTT，XTT，MTS或WST-1等。

CCK-8法的优势

Features

比MTT，MTS或WST-1更敏感

对细胞无毒性

步骤更简单，无需有机溶剂

稳定的试剂，即用型

质量控制

Protocol

1.简介

相比以前的方法如 MTT 检测，Cell Counting Kit-8（CCK-8）为细胞数测定和细胞增殖/毒性测

定的研究提供了更方便和灵敏的方法。我们使用了一种高水溶性的四唑盐，WST-8

[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodiu

m salt]，它在电子耦合试剂存在下还原产生水溶性 formazan 形式的染料，如 Figure. 1 所示。

Figure.1 WST-8 和 WST-8 formazan 结构

我们的产品 CCK-8 已经与电子耦合试剂混合，是即用型。WST-8 可被活细胞中丰富的脱氢酶

还原，转化为 formazan 形式，这是一种可溶于培养基的橙色染料（Figure. 2）。脱氢酶产生

的 formazan 的量与活细胞的数量呈直接的线性关系。

Figure.2 检测原理

CCK-8 试剂盒为细胞增殖和细胞毒性检测中测定活细胞数提供了灵敏的比色检测。以往的研

Protocol

究表明，CCK-8 的检测灵敏度高于其他四唑盐，如 MTT，XTT，MTS 或 WST-1。由于 WST-8

formazan 是水溶性的，因此不再需要添加 DMSO 等有机溶剂。WST-8 formazan 在 450nm 处

的吸光度与培养基中活细胞的数量呈线性关系，活细胞数可以使用对应的吸光度值和标准曲

线确定。CCK-8 检测也可以代替[3H]-thymidine 掺入检测。

2.需要的的设备和材料

酶标仪 (450 nm 滤光片)

96 孔板

10 μl, 100-200 μl 多通道移液器

细胞 CO2培养箱

3.细胞活性检测

3.1. 将细胞悬液（100 μl /孔）接种在 96 孔板中。在潮湿的培养箱中预培养一定时间（例如，

在 37℃，5％CO2下）。

3.2. 向板的每个孔中加入 10 μl CCK-8 溶液。 注意不要向孔中引入气泡，因为它们会干扰

O.D. 值检测。

3.3. 将培养板放在培养箱中孵育 1-4 小时。

3.4. 使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。

如果不立刻测量吸光度，可在每个孔中加入 10μl 1％w / v SDS 或 0.1 M HCl，盖好并在室温下

避光保存。24 小时内不会观察到吸光度变化。

4.细胞增殖/毒性检测

4.1. 在 96 孔板中每孔接种 100 μl 细胞悬液（约 5000 个细胞/孔）。将板在潮湿的培养箱中预

培养 24 小时（例如，在 37℃，5％CO2下）。

4.2. 向孔中加入 10 μl 不同浓度的待测物质。

4.3. 将培养板在培养箱中孵育适当的时间长度（例如，6, 12, 24 或 48 小时）。

4.4. 向板的每个孔中加入 10 μl CCK-8 溶液。 注意不要向孔中引入气泡，因为它们会干扰

O.D. 值检测。

4.5. 将培养板在培养箱中孵育 1-4 小时。

4.6. 在读取平板之前，可以在摇床上温柔的混匀。然后使用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。

如果不立刻测量吸光度，可在每个孔中加入 10μl 1％w / v SDS 或 0.1 M HCl，盖好并在室温下

避光保存。24 小时内不会观察到吸光度变化。

5.数据分析

统计分析有几种方法，您可以选择使用 O.D.值或细胞数量，我们提供其中一种方法。

细胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100

抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100

As =实验孔吸光度（含有细胞，培养基，CCK-8 和待测化合物的孔的吸光度）

Ab =空白孔吸光度（含有培养基和 CCK-8 的孔的吸光度）

Ac =对照孔吸光度（含有细胞，培养基和 CCK-8 的孔的吸光度）

Protocol

6.制作标准曲线

6.1. 细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数

6.2. 使用培养基，等比稀释细胞悬液为一个浓度梯度，通常需要 5-7 个浓度梯度，每组几个

复孔。然后接种细胞。（注意每孔的细胞数量。如果您将细胞悬液稀释在管中，在加入培养

板的孔之前，请小心再次混匀细胞。每孔中细胞悬液的体积应该是一致的。）

6.3. 培养直至细胞贴壁（通常 2-4 小时），然后每 100 μL 培养基加入 10 μL CCK-8。继续孵育

1-4 小时，用酶标仪测量 450nm 处的吸光度。制作出一条以细胞数为 X 轴坐标，O.D.值为 Y

轴坐标的标准曲线。

可以基于该曲线确定待测样品的细胞数。使用此标准曲线的先决条件是培养检测条件相同。

7.注意事项

7.1. 确保药物和 CCK-8 均匀分布在培养基中。

7.2. 细胞增殖越多, 颜色越深; 细胞毒性越强，颜色越浅。

7.3. 对于贴壁细胞，每孔至少需要 1000 个细胞（100 μl 培养基）。对于白细胞，由于灵敏度

较低，每孔至少需要 2500 个细胞（100 μl 培养基）。推荐的 96 孔板每孔最大细胞数为 25000.

如果使用 24 孔或 6 孔板进行该检测，请计算相应的每孔的细胞数，并调整 CCK-8 的体积，

使其为每孔总液体体积的 10％。

7.4. 因为 CCK-8 测定是基于活细胞中的脱氢酶活性，影响脱氢酶活性的条件或化学物质可能

导致实际活细胞数与使用 CCK-8 测定活细胞数之间有差异。

7.5. WST-8 可能与还原剂反应生成 WST-8 formazan。如果使用还原剂 (例如一些抗氧化剂)会

干扰检测。如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。

7.6. 孵育 2 小时后，背景 O.D.值一般为 0.1-0.2 单位。

7.7. 注意不要在孔中引入气泡，因为它们会干扰 O.D.值。

7.8. 如果您想对 CCK-8 溶液进行灭菌，请使用 0.2 μm 的膜过滤溶液。

7.9. 孵育时间因孔中细胞的类型和数量而异。通常，白细胞着色较弱，因此可能需要较长的

孵育时间（长达 4 小时）或大量细胞（~105细胞/孔）。

7.10. 如果细胞悬液中存在高浊度, 测量并减去样品在 600nm 或更高波长的 O.D 值。

7.11. CCK-8 不能用于细胞染色。

7.12. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中

本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

7.13. CCK-8的毒性非常低，在CCK-8测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，例如

结晶紫测定，中性红测定或DNA荧光测定。（除非细胞极为稀少，不推荐。）

7.14. 该试剂盒可用于大肠杆菌，但不能用于酵母细胞。

7.15. 在读取平板之前，您可以在摇床上轻柔混匀。

7.16. 我们建议将细胞接种在靠近培养板中央的孔中，最外围一圈孔中的培养基容易蒸发，

可以用PBS，水或培养基填充这些孔。

7.17. 如果您没有 450 nm 滤光片。您也可以使用吸光度在 430 和 490 nm 之间的滤光片, 450

nm 滤光片具有最佳灵敏度。

7.18. 测量 450 nm 处的吸光度，如果您需要进行双波长测定，作为参考波长可以测定 650 nm

处的吸光度。

7.19. 药物中金属离子的存在可能会影响 CCK-8 的灵敏度。终浓度为 1 mM 的氯化亚铅、氯

化铁、硫酸铜会抑制 5% 、15% 、90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是 10 mM

的话，将会 100% 抑制。

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