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BIO-rad BIO-rad 北京代理
产品时间：2020-03-16
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BIO-rad代理 北京华新康信生物科技有限公司
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DNA 甲基化研究，进来了解一下～
DNA 甲基化（DNA methylation）是 DNA 修饰途径之一，即在甲基转移酶的催化下，DNA 的 CpG 两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成 5－甲基胞嘧啶（5-mC）。目前有大量研究证实，DNA 甲基化异常往往会引起染色质结构、DNA 稳定性等发生改变，抑制相关基因转录调控导致疾病发生，如肿瘤、血管类疾病、神经紊乱等。DNA 甲基化状态亦可作为疾病诊断、监测及预后的重要 Biomarker1，4，5，6。
小编粗略盘点了一下目前常用的几种 DNA CpG 甲基化检测方法，下面进入扫盲时刻：
亚硫酸氢盐处理+测序（BSP）：经过亚硫酸氢盐处理后，未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；通过 PCR 扩增目的片段，并对产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断 CpG 位点是否发生甲基化。
甲基化特异性 PCR（MS-PCR）：在亚硫酸氢盐处理后，使用分别针对甲基化和非甲基化的序列设计的引物开展 MS-PCR，用电泳检测 MSP 扩增产物。若针对甲基化序列设计的引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化；反之则则说明该检测位点不存在甲基化。
甲基化敏感性限制性内切酶法（MSRE）：基于甲基化敏感 Ⅱ 型限制性内切酶不能切割含有一个或多个甲基化切点序列的基本原理，酶切产物经电泳分离，探针杂交，扫描定量后得出原样本中甲基化的比例。
甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法（MS-HRM）：经亚硫酸氢盐处理后，甲基化与未甲基化 DNA 存在序列差异，可通过熔解温度及峰型的变化区分*甲基化、*非甲基化或杂合甲基化。
焦磷酸测序（Pyrosequencing）：基于引物延伸的焦磷酸测序技术，通过将链合成过程中释放出的焦磷酸（PPi）转化成光信号， 转换成一个峰值，其高度与核苷酸数目成正比。经重亚硫酸盐处理的序列可看作是 C>T SNP 位点。因此可凭借信号峰值高低来确定甲基化状态。
荧光定量法（Methylight）：利用亚硫酸氢盐处理 DNA 样本，设计分别针对待测序列甲基化和非甲基化状态的 Taqman 探针和引物进行荧光 PCR 扩增，以区分 CpG 甲基化和非甲基化状态。
上述几种方法各有优缺点，比如 BSP，结果可靠，度高，但需要大量的克隆，操作过程繁琐；MSRE，需要找到合适的酶切位点，受转化不*影响；MS-HRM，对仪器要求高，需要有 HRM 模块的荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad 定量仪器均有此功能）；Pyrosequencing，过程复杂。
除此之外，还有高通量检测技术，如质谱、靶向测序、illumina450k、850k 芯片、Pacific Bioscience 的 SMRT 测序、Oxford Nanopore 测序等。
QX200 微滴式数字 PCR（ddPCR）技术以分子计数的方式实现对靶标核酸序列的定量而不依赖标准曲线，且检测的灵敏度、重复性和准确性有很大提高。ddPCR 技术在癌症分子标志物发现、病毒载量分析、传染病研究、基因组结构变异及 NGS 文库定量等方面得到广泛应用。
而在 DNA甲基化研究方面 ddPCR 灵敏度更高，能在高丰度非甲基化背景下检测出甲基化序列，耐受前期处理带来的 PCR 抑制物的干扰，提高灵敏度，而且还能准确定量。
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