Toxin实验报告

发布时间： 2023-03-23　　点击次数： 597次

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BNIP3调节恶性周边神经腱鞘瘤细胞中的 AT101[(-)-棉酚]诱导的死亡

更正2015年8月27日: Kaza N，Kohli L，Graham CD，Klocke BJ，Carroll SL，et al。(2015)更正: BNIP3调节 AT101[(-)-棉酚]诱导的恶性周边神经腱鞘瘤细胞死亡。PLOS ONE 10(8) :

恶性外周神经鞘肿瘤(MPNST)是一种侵袭性雪旺细胞来源的肉瘤，是导致神经纤维瘤(NF1)患者死亡的主要原因。目前的治疗方法在很大程度上是无效的，导致 MPNST 复发率高，5年患者生存率差。这就需要对 MPNST 患者进行替代化方案的探索。本研究旨在评估 BH3-模拟物 AT101[(-)-棉酚]在体外对 MPNST 细胞的细胞毒作用，并鉴定 AT101诱导的 MPNST 细胞死亡的关键调节因子。我们发现 AT101引起半胱天冬酶非依赖性，非凋亡性 MPNST 细胞死亡，伴随着自噬，并通过 HIF-1α 诱导的非典型 BH3-only 蛋白 BNIP3的表达介导。这些作用是由细胞内铁螯合介导的，这是以前未报道的 AT101细胞毒性机制。

引文: Kaza N，Kohli L，Graham CD，Klocke BJ，Carroll SL，Roth KA (2014) BNIP3调节 AT101[(-)-棉酚]诱导的恶性周边神经腱鞘瘤细胞死亡。PLoS ONE 9(5) : e96733. 斯宾塞 · 吉布森，曼尼托巴大学，加拿大收到: 2013年12月19日; 接受: 2014年4月10日; 发表: 2014年5月13日版权: 2014 Kaza et al。这是一篇开放获取的文章，根据知识共享的署名许可条款分发，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，只要原作者和来源被署名。资金: 这项工作得到了国家癌症研究所赠款 CA134773(KAR，SLC)和 CA122804(SLC) ，全国神经紊乱和中风研究院赠款 NS41962(KAR)和国防部赠款 X81XWH-09-1-0086和 W81XWH-12-1-0164(SLC)的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定发表或准备稿件方面没有任何作用。相互竞争的利益: 作者宣称不存在相互竞争的利益

恶性外周神经鞘瘤(MPNST)是高度侵袭性的雪旺细胞来源的肉瘤，经常发生于良性丛状神经纤维瘤[1]。大约一半的多发性神经营养不良症是零星出现的，其余的发生在神经纤维瘤(NF1)患者中。NF1是影响人类神经系统的最常见的遗传性常染色体显性遗传病，在3500名新生儿中发生1例，NF1患者中有8-13% 在其一生中发展为 MPNST [3]。目前治疗 MPNST 的标准是手术，然而，完整的手术切除往往是不可能的，MPNST 侵袭邻近组织和转移[4]。放治疗抑制局部 MPNST 复发，但不增加患者生存率。化同样无效。因此，MPNST 是 NF1患者死亡的主要原因[5]。鉴于这些有限的治疗选择和 MPNST 的攻击性行为，需要新的治疗方法。通过逃避细胞凋亡来抵抗细胞死亡的能力是肿瘤细胞的一个标志[6]。这种癌细胞特征部分反映了调节内在线粒体凋亡途径的促凋亡和抗凋亡 BCL-2蛋白之间平衡的失调[7]。BCL-2家族的抗凋亡成员(BCL-2，BCL-xL，BCL-w，MCL-1和 A-1)通过与包埋在线粒体外膜中的多结构域促凋亡成员(BAX 和 BAK)结合来抑制细胞凋亡。许多癌症过度表达 BCL-2家族的抗凋亡成员，并对死亡刺激具有抗性[8]。与丛状神经纤维瘤相比，MPNST 表达高水平的 BCL-xL，这被认为与其化耐药性有关[9]。此外，抑制 BCL-xL 使 NF1衍生的 MPNST 细胞对化敏感[10]。

AT101[(-)-棉酚乙酸]是棉酚的一种改性左旋对映体，棉酚是存在于棉籽中的一种天然多酚醛[11]。尽管自20世纪60年代中期以来，棉酚作为抗肿瘤药物的使用已被探索[12] ，[13] ，但在2000年代初被发现是 BH3模拟物时，它作为一种可行的抗癌药物重新受到关注[14]。BH3模拟物与 BCL-2同源结构域3-only (BH3-only)蛋白相似，并与抗凋亡 BCL-2蛋白的 BH3结合沟相互作用，从而阻止其与促凋亡 BCL-2家族蛋白 Bax 和 Bak 的相互作用。先前已经表明，棉酚抑制 BCL-2，BCL-xL 和 MCL-1的抗凋亡功能[15]。有趣的是，棉酚之前也作为一种男性抗生育药物在临床试验中进行了测试[16] ，[17]。棉酚的抗生育作用被认为是由于抑制精原细胞的能量代谢[18] ，而不是其作为 BH3模拟物的作用。其他几种细胞毒作用模式也归因于棉酚，包括抑制 DNA 合成和细胞周期停滞[19] ，改变细胞内钙调节[20] ，抑制蛋白激酶C [21] ，与类固醇受体共激活因子的相互作用[22]和调节线粒体凋亡信号传导的几个组分[23]。最近也有证据表明棉酚可以诱导自噬，在某些情况下导致自噬性细胞死亡[24]。鉴于这些多重作用，棉酚诱导任何特定肿瘤类型的细胞死亡的主要机制可能会有所不同，这取决于抗凋亡 BCL-2蛋白和其他肿瘤细胞特异性因子的水平。

本研究的目的是确定 AT101是否在体外对 MPNST 细胞发挥细胞毒作用，并探讨其潜在的分子作用机制。我们发现 AT101引起 MPNST 细胞半胱天冬酶非依赖性的非凋亡性细胞死亡，伴随的自噬不具有细胞保护作用。我们显示 AT101诱导 BCL-2/E1B-19K 相互作用蛋白3(BNIP3)的表达，BNIP3是一种非典型的仅 BH3蛋白，其促进 AT101诱导的细胞死亡。我们还证明 BNIP3的表达是通过缺氧诱导因子 -1α (HIF-1α)的核内积累来促进的，HIF-1α 可以通过补铁来消除。我们的研究结果进一步认为 AT101细胞毒性的机制之一是螯合细胞内铁。抗体和其他试剂

从以下来源获得一抗: HIF-1α，BECLIN1，BIM，BCL-xL，β-微管蛋白，铁蛋白 HC 和转铁蛋白受体 -1(TfR1/CD71; Santa Cruz Biotechnology Inc. ，Santa Cruz，CA) ; BNIP3(Sigma，St. Louis，MO) ; Lamin A/C (BD TransductionLaboratories，Franklin lake，nJ) ; GAPDH，BCL-2和 PUMA (Cell Signaling，丹弗斯，MA) ; LC3(Abgent，San Diego，CA)。分别从 Biorad (Hercules，CA)和 Cell Signaling (Danvers，MA)获得辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗兔和马抗小鼠抗体。 AT101由 Ascenta Therapeutics (Malvern，PA)提供。BOC- 天冬酰胺(Ome)-氟甲基酮(BAF)和柠檬酸铁购自 MP Biomedicals (Aurora，OH) ，Bafilomycin A1(BafA1)来自 A.G. Scientific (San Diego，CA)和3-甲基腺嘌呤(3MA) ，星孢菌素(STS) ，甲磺酸去铁胺(DFO) ，来自 Sigma (St.Louis，MO)的二甲基亚砜(DMSO)。ABT-737购自 TX 休斯敦的塞莱克化工有限公司

Cell CultureWe 先前描述了本研究中使用的人 NF1相关的 MPNST 系 T265-2c 细胞，ST88-14细胞和90-8细胞的来源[25]。这些细胞系的身份按照 ATCC 技术公报8中概述的规范进行例行验证。简而言之，细胞的形态和倍增次数是常规评估的，细胞的身份是通过微卫星分析来验证的。细胞也定期检测支原体感染。将所有细胞系在含有1% 青霉/链霉(Invitrogen，卡尔斯巴德，CA) ，1% L- 氨酰胺(Sigma，St.Louis，MO)和10% 胎牛血清(FBS; Hyclone，Logan，UT)的 DMEM10[ DMEM (Sigma，St.Louis，MO)]中培养，并在37 °C 下在潮湿的5% 二氧化碳，95% 空气气氛中温育。将细胞以20,000/孔的密度铺在未涂布的48孔板上，并以106个细胞/培养皿的密度铺在100mm 培养皿中。培养物用于实验后24小时电镀。在补充有5% FBS 的培养基中进行药物治疗。细胞活力，Cytotoxicity，细胞凋亡和体外半胱天冬酶切割测定使用 calcein-AM (Life Technologies，卡尔斯巴德，CA)转化测定来测量细胞活力。使用化学底物 devD-7-氨基 -4-甲基豆素(AMC)(Enzo Life Sciences，Framingdale，NY) ，用体外半胱天冬酶 -3切割测定评估半胱天冬酶活化。这两种检测方法均如前所述进行[26]。使用哺乳动物细胞的 LIVE/DEAD 活力/细胞毒性试剂盒和来自分子探针公司公司(Eugene，OR)的 Annexin V Alexa Fluor 488和碘化丙啶的死细胞凋亡试剂盒评估细胞毒性和细胞凋亡。遵循制造商的指示，并使用 BD FACSCalibur 流式细胞仪测量乙锭同型二聚体 -1，Alexa Fluor 488和碘化丙啶的荧光。

通过去除培养基，用 PBS 洗涤细胞，用细胞提取器刮除细胞，然后通过以3000rpm 离心10分钟将它们沉淀来制备全细胞裂解物。将细胞沉淀重悬于含有20mM Tris-HCl (pH7.4) ，150mM NaCl，2mM EDTA，1% Triton X-100,10% 甘油，蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，St.Louis，MO)和磷酸酶抑制剂鸡尾酒1和3(Sigma，St.Louis，MO)。将裂解物澄清并储存在 -80 °C。30μg 蛋白质按照我们之前描述的方案进行免疫印迹[27]。除 GAPDH 和 LAMIN (1∶5000)外，其余一抗均稀释至1∶1000。通过增强型化学发光(Pierce ECL; Thermo Scientific，沃尔瑟姆，MA)检测免疫活性物种。按照制造商的说明，使用 NE-per 提取试剂盒(Thermo Scientific，沃尔瑟姆，MA)提取核和细胞质部分。

一抗在以下工作浓度下使用: LC3(Abgent; 1∶1000) ，BNIP3(Sigma; 1∶100)。HRP 缀合的抗兔超级图片(Invitrogen; 用于 LC3)和抗小鼠 ImmPRESS (Vector Laboratories; 用于 BNIP3)均以1∶100稀释使用。使用 Cy3(Perkin-Elmer Life Science Products)的酪胺信号扩增系统检测免疫反应性。双苯并酰亚胺(1μg/mL; Hoechst 33258; Sigma)用于核复染。样品使用装有 AxioCam 数码相机的蔡司 Axioskop 荧光显微镜进行检查。使用 Axio Vision Rel 捕获和分析图像。4.8软件(卡尔蔡司显微成像)。用 RNeasy Plus 微型试剂盒(Qiagen)分离了逆转录和实时定量 PCR RNA。随后使用高容量 cDNA 逆转录试剂盒(Applied Biosystems)合成 cDNA。使用 Maxima SYBR Green/ROX qPCR 主混合物(Thermo Scientific，沃尔瑟姆，MA)进行实时定量 PCR 测定，并从 Life Technologies (Carlsbad，CA)获得探针。在 Stepone Plus 实时 PCR 系统(Applied Biosystems)中进行扩增。从 Harvard PrimerBank 中选择以下正义/反义引物和探针，用于检测人 BNIP3(5’-TGAGTCTGGACGGAGTAGCTC-3’和5’-CCCTGTTGGTATCTTGTGGTGT-3’) ，HIF-1α (5’-GAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCG-3’和5’-CCTTATCAAGATGCGAACTCACA-3’) 用 ΔΔCT 方法(Livak and Schmittgen，2001)进行分析，并使用 ACTIN RNA 水平作为参考对数值进行调整。

RNAiBNIP3和 HIF-1αsiRNA (siGENOME SMARTPool)购自 Thermo Scientific (Waltham，MA) ，并根据制造商的说明重新构建。将细胞铺在 DMEM10中，并在铺板后24小时使用 X-tremeGene siRNA 转染试剂(Roche，Indianapolis，IN)以5∶2的比例转染[转染试剂(μl) : 寡核苷酸(μg)]。第二天，新鲜培养基被添加到细胞中。转染后48小时复制转染细胞，转染后72小时处理。使用来自 Teco Diagnostics (Anaheim，CA)的 Iron/TIBC 试剂组的修改方案，在无细胞系统中评估 AT101，ABT737和 DFO 的铁结合特性。简而言之，对测量不饱和铁结合能力(UIBC)的方案进行了修改，以评估溶液中相应药物的铁结合能力。将等体积的 UIBC 缓冲液(Tris 缓冲液0.5 M，pH8.0，表面活性剂和氮化钠)加入到所有孔中，然后等体积的铁标准物与试剂盒一起供应，空白除外。不同浓度的 AT101，ABT737和 DFO 被添加到各自的井和体积平衡的无铁水。在560nm 读取基线吸光度后，向所有孔中加入等体积的铁显色剂(盐酸羟胺中的 Ferrozine 16.6 mM) ，并将平板在37 °C 温育10分钟。孵育后，在560nm 处再次读取吸光度。根据制造商的说明书计算铁的含量。

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