Ambeed报告结果

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Ambeed结果和讨论自旋标记的合成及其插入依替非巴肽中除了最后一步外，目标化合物4和5的合成是根据文献(方案2)58完成的。经过双重 MANNICH 型反应后，所得中间体直接用于以4-甲基噻吩为亲核取代反应的后续重结晶中，产生63% 的联合收率的双硫醚7。H2O2在乙酸中氧化7后，通过1-乙基 -3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)介导的酰胺偶联反应将双磺酸8与4-氨基 TEMPO 偶联。经柱色谱法净化后，产物成为双砜4和烯丙基砜5不可分离的混合物。考虑到这样一个事实，即在插层化学反应条件下，4被转化为活性的 MICHAEL 受体5，没有试图分离这两种化合物。成功地制备了目标化合物混合物4/5，然后将自旋标记引入到依非巴肽的二硫桥中。这项工作需要两个步骤，详见计划3。计划3 第一1被二硫苏糖醇(DTT)还原以打开二硫键59，产生双硫醇2。经半制备型高效液相色谱纯化后，用于后续的插层反应。为此，在烯丙基砜5中加入2，该烯丙基砜5是由其与双砜4的混合物通过温和碱处理制备的。预期的双重 MICHAEL 反应在半制备高效液相色谱法之后按预期发生，以12% 的收率递送最终产物3。自旋标签插入 eptifibatide 的证明自旋标签的共价插入是由电喷雾离子法质谱法质谱(ESI-MS)和高效液相色谱(HPLC)证实的。插入过程可以通过比较每个步骤的 HPLC 痕迹来完成(图1) ，并且在产物分离后通过自旋标记化合物3的质谱来验证(图2)。图1 自旋标签混合物的 HPLC 痕迹显示双砜4(tR = 18.3 min)和烯丙基砜5(tR = 16.1 min)的不可分离化合物(图2d)。通过 HPLC-MS (ESI 图9)验证了双砜基自旋标记及其活化物质的共存。通过比较显示1与 tR = 7.2分钟，还原2与 tR = 7.9分钟和标记3与 tR = 10.7分钟的 HPLC 痕迹，可以明确地监测插层过程。(图1a-c)。为了确认在 tR = 10.7 min 时信号分配为标记的3，记录并模拟了 ESI-MS 光谱(图2)。正如预期的3，观察到的1175.5 m/z 和588.3 m/z 的质量清楚地表明自旋标记的依非巴肽分子质量[ M + 1H ] + 和[ M + 2H ]2 + 。由于单一和双重附着的自旋标签的质量相等于1175.5 m/z，所以自旋标签与两个巯基的依非巴肽的成功结合不能用质谱法来确定。由于这个原因，游离硫醇基团的量由 Ellman 试验60,61,62确定，使用二硫苏糖醇(DTT)作为标准和 Ellman 试剂(5,5’-二硫-双(2-硝基苯甲酸) ，DTNB)。DTNB 与游离巯基反应生成混合的二硫化物和2-硝基 -5-硫代苯甲酸(TNB)(上图3)。在这个反应中，DTNB 的目标是一个自由巯基的共轭碱(R-S -)。在412 nm60,61,62时，摩尔消光系数为14.150 M-1 cm-1。TNB 的灭绝不受 pH 值在7.6至8之间变化的影响。巯基可以通过使用已知浓度的巯基如二硫苏糖醇(DTT)来估计样品中的巯基，检测其每 UV-Vis 的吸光度(图3a) ，导致校准曲线(图3b)。用二硫苏糖醇(DTT)还原 Ellman 试剂(DTNB)(上图)。(a)二硫苏糖醇(DTT)浓度依赖的紫外光谱和依替非巴肽在 Ellman 试剂(DTNB)存在下的紫外光谱。(b)在与 Ellman 试剂(DTNB)还原反应后，用已知浓度的二硫苏糖醇(DTT)在412nm 处校正紫外光的吸光度曲线。Ellman 的实验表明，在 pH 8时，自旋标记的依替非巴肽通过附着在两个巯基上，由至少90% 完整插入的自旋标记组成。由此得到的硫醇浓度(见表1)与使用先前公布的硫醇群的校准曲线得到的浓度非常一致[60,61,62]。表1根据文献60,61,62，基于图3b 所示的校准曲线或通过利用 TNB (2-硝基 -5-硫代苯甲酸)的消光系数，18μM 自旋标记的依替非巴肽的硫醇浓度。总之，我们成功地合成了基于双砜的自旋标签4及其反应性消除产物5的混合物，并且我们成功地应用该混合物通过将标签选择性插入到其二硫键中来标记环七肽。插入后自旋标记活性的证据随着标记的3在手，我们接下来测量 EPR 光谱，以验证其自由基特征作为预期的 DNP 测量的先决条件(图4)。(a)自旋标记的依替非巴肽3(蓝色) ，(b)双砜基自旋标记4(橙色)和(c) TEMPO 作为参考(黑色)的 EPR 光谱。注: 光谱归一化的最大强度(左侧)。光谱显示没有标准化(右侧)。所有样品的实验条件相同。样品在293k 的 DMSO 浓度为1mM 时测量。全尺寸图像标记的依替非巴肽3，自旋标签4/5和4-氨基-TEMPO 参考的 EPR 光谱显示由不成对电子自旋和14N 氮(S = 1)之间的超精细相互作用引起的预期三重态，因为它是典型的氮氧化物自由基。由于使用这些实验对信号进行绝对量化是不可行的，我们通过光谱的双重积分进行了半定量分析。为此，我们比较了 TEMPO、双砜自旋标记和自旋标记的依非巴肽的 EPR 谱线的绝对积分。以 TEMPO 为参照，结果表明双砜自旋标记的相对活性为90% ，自旋标记的依非巴肽的相对活性为79% 。基于这些结果，我们接下来研究了自旋标记的3在典型的 DNP 溶剂混合物甘油 -d8/D2O/H2O = 60/30/10(v/v)中的 DNP 活性。为了确保自旋标签在这种溶剂混合物中的稳定性，进行了 HPLC 分析。标记的依替非巴肽的 HPLC 痕量在其整齐的形式和在上述溶剂混合物(见 ESI 图14)的比较显示没有显着差异，从而证明其在测量条件下的稳定性。为了检查 DNP 应用的偏振转移效率，记录了1H MAS NMR (图5a)和1H13C CP MAS NMR (图5b)光谱。通过1H MAS 光谱(图5a)与微波辐照(MW On)和无微波辐照(MW Off)的比较，观察到微波辐照下的信号比“ MW Off"光谱增强了14倍。图5图51H (a)和1H13C CP MAS NMR (b)15mM 自旋标记的依非巴肽3在具有(MW on)和不具有(MW off)微波辐照的甘油 -d8/D2O/H2O 基质中的谱在9.4 Tesla 以8kHz 的自旋速率测量。在13C 光谱中，60.7 ppm 和70.5 ppm 处的两个信号表示甘油，0 ppm 处的小信号归因于标有 # 的硅塞，用于紧密关闭核磁共振转子中的液体。星号表示13C 光谱中甘油的自旋边带和1H 光谱中水的自旋边带。在这个样品的1H13C CP MAS NMR 谱中，甘油碳原子的信号在60.7和70.5 ppm 处有更高的信号增强。两个信号都增强了19倍(图5b) ，相当于节省了361倍的时间。这意味着在固态 DNP 分析中使用这种自旋标记将比标准固态核磁共振测量时间从一年减少到一天。1H 和1H13C CP MAS NMR 增强之间的明显差异最可能与来自未极化的质子的固有背景信号有关[63]。的信号在光谱中未被检测到，最可能是由于其浓度低(约15mM) ，其比 DNP 基质中甘油 -d8(8.2 M)的浓度小约550倍。此外，由于依替非巴肽的尺寸相对较小，由于信号漂白，在光谱中只能看到甘油的13C 核。这种现象已被详细描述用于 DNP 核磁共振实验中的其他硝基自由基系统64,65以及蛋白质系统中的自由基自旋标记66。为了强调这些假设，需要对依替非巴肽进行同位素标记，这超出了这项工作的范围。结论本文合成了一种新的位点选择性双砜自旋标记，并证明了其适用于将 TEMPO 衍生的自旋标记插入生物活性分子的二硫键中。合成了双砜4及其 β-消除产物5的双组分混合物，其中双组分都可以参与标记反应，因为在反应条件下消除产生了活性 MICHAEL 受体5。作为预期插入过程的可行性的例子，将自旋标签插入依非巴肽3的二硫键中，依非巴肽3是一种合成的环七肽，来源于在响尾蛇纤毛虫巴布林的毒液中发现的去整合素蛋白。EPR 分析表明，自旋标记物与依替非巴肽的二硫键结合后仍能保持其活性。考虑到将自旋标记插入二硫键(DTT 还原)所需的还原条件，这是一个重要的结果67。最后，成功地进行了固态 DNP NMR 测量，导致来自基质的质子的 DNP 信号增强14和甘油的碳的 DNP 信号增强19，这对应于高达361的时间节省因子。虽然这里使用的低分子量3证明了将自旋标记插入 S-S 键的主要可行性，但只有基质的超极化13C- 核在13C-NMR 谱中被解析，我们假设观察较大的结合伴侣的细胞核如活化的血小板糖蛋白 IIb/IIIa 受体在结合研究中66,68。这些令人鼓舞的结果为开发和应用强大的工具铺平了道路，用于将位点选择性自由基自旋标记引入生物分子和生物固体，而不损害其构象完整性，用于采用固态 DNP 或* EPR 技术的结构研究。此外，应该可以使用这种或类似的化合物进行超感官溶解二硝基酚的应用，以研究药代动力学作为一种非侵入性的方法。除非另有说明，所有材料均购自商业供应商(Fisher Scientific，Acros Organics，Merck，ABCR，Alfa 棉花糖) ，并且未经进一步纯化而使用。Eptifibatide (CAS: 188627-80-7)购自 Ambeed 公司。以高效液相色谱级别购买溶剂，并以甲苯共沸蒸馏干燥羟基苯并三唑。用于核磁共振波谱的氘化溶剂购自 Sigma-Aldrich 公司。方案4收集所有合成化合物。使用硅胶(SilG/UV 252，平板厚度: 0.25 mm)由 Macherey-Nagel GmbH & Co. 进行薄层色谱。KG.通过 UV 荧光和用 KMnO4猝灭或氧化来实现可视化。表征已经使用 Bruker 300MHz Avance III NMR 谱仪或300MHz Avance II NMR 谱仪(1H-NMR 300.16 MHz，13C NMR 125.78 MHz)在 TU Darmstadt 的服务部门进行了液体 NMR 溶液状态 NMR 测量。化学位移以 ppm 表示。采用溶剂峰的化学位移作为内标。反相高效液相色谱法(RP-HPLC)反相高效液相色谱法(RP-HPLC)用于分析目的，使用由配备 Waters 2998 PDA 检测器的 Waters Alliance e2695组成的 Waters HPLC 装置进行。检测波长的选择取决于214,254,280和301纳米之间的分析物。高效液相色谱系统的洗脱体系包括洗脱剂 A (0.1% aq。TFA)和洗脱液 B (含0.1% TFA 的99.9% 乙腈)。除非另有说明，否则以2ml/min 的流速进行高效液相色谱分析，在洗脱液 A 中洗脱液 B 的20% 至80% 的洗脱液梯度超过20分钟。使用来自 Macherey 的 Nucleosil 100-5c18柱(5μm，100Å)进行分析。在 Knauer Multokrom RP18柱20 × 250mm (5μm，100Å)上进行肽的制备纯化，使用9mL/min 的流速和在60分钟的过程中不含 TFA 的乙腈梯度从0到50% 。Ellman’s testEllman’s 检验根据文献60,61,62量化游离巯基。DTNB (5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸，Ellman 试剂)与游离巯基反应生成混合二硫化物和2-硝基 -5-硫代苯甲酸(TNB)。因此可以在412nm 处检测到 TNB 的吸光度。在这方面，二硫苏糖醇(DTT)被用作校准的标准。将8mg DTNB 溶于1ml DMSO 中，制备20mM DTNB 原液。用0.1 m 二水合磷酸一氢钠(pH8.0)将原液稀释100倍，得到0.2 mM 二硝基三硝基苯工作溶液。通过向每个1ml 离心管中加入510μl 0.2 mM DTNB 工作溶液，加入50μl 在 DMSO 中具有已知浓度的样品并通过涡旋混合来实现 DTNB 的还原反应。将50μlDMSO 加入到510μl0.1 mM DTNB 工作溶液中进行空白处理。室温培养时间约为10分钟。用 J & M Analytik AG TIDAS S 光谱仪在412nm 处对空白样品进行吸光度测定。电喷雾质谱法(ESI-MS)电喷雾电离(电子喷雾电离)质谱记录与布鲁克先生-LC 质谱仪在德国达姆施塔特工业大学服务部。所有样本的电子顺磁共振电子自旋共振(ePR)光谱均在一台配备了一个 a TC h03温度控制器和一个9.43 GHz 的长方形 TE102谐振器的电子顺磁共振微型显微镜 MS-400(Magnettech，Germany)上测量。记录所有 EPR 光谱，调制振幅为0.1 mT，调制频率为100kHz。在24dB 的微波衰减下，获得了尾数增益为1和指数增益为1的光谱。测量在298K 下进行。用337mT 的中心 B0磁场扫描14mT 的磁场范围，扫描时间为60s，获得2048个点。动态核极化(DNP) NMR 实验所有的测量都在 Bruker Avance NEO 400MHz DNP 光谱仪上进行，该光谱仪配备有4.8 T Bruker 回旋管系统，以263GHz 的频率产生微波(MW)。在1H/13C/15N 配置中使用3.2 mm 低温三重共振探针，导致1H 的中心频率为400.2 MHz，13C 的中心频率为100.6 MHz。样品温度为97 K 或107 K 的测量没有或与微波辐照，分别名义上注意到。温度的差异是由于在一个固定的最大冷却功率的兆瓦辐照造成的。所有1H 和1H →13C CP MAS 均采用8kHz 的 MAS 旋转频率，1H MAS 测量采用 π/2激发脉冲2.3 μs，循环延迟5s4扫描。通过将硅塞信号设置为0 ppm，参考 TMS 的光谱，记录了接触时间为2ms 的1H →13C CP MAS 实验，设置了18.2 s 的循环延迟，并进行了8次扫描。循环延迟设置为1.3倍 T1的质子，这是测量与 T1建立的实验使用饱和恢复脉冲序列。13C 光谱参考相对于信号的硅插头(- 硅-甲烷0 ppm)。为了解耦的质子脊柱-64脉冲序列被使用69。

双砜基自旋标记的合成双硫醚的合成(文献48)5.66 g (34.48 mmol，1.00 eq。)4-乙酰苯甲酸，5.01克(167.0 mmol，4.84当量)多聚甲醛和13.62克(167.0 mmol，4.84 eq)盐酸二甲胺在异丙醇中稀释，加热回流24小时，冷却后出现沉淀，通过加入水分解。加入8.56克(68.95 mmol，2.00当量)后4-硫醇和 Ar 气氛的应用。反应再加热回流24小时，冷却至室温后过滤沉淀固体。固体用水冲洗，干燥并在甲醇中重结晶得到产品为无色固体。产量9.47克(63%) ;1H-NMR (300MHz，CDCl3,301.2 K) : δ (ppm) = 11.11(bs，1-COOH) ，8.06(d，3J = 8.3 Hz，2-H10) ，7.63(d，3J = 8.3 Hz，2-H11) ，7.15(d，3 J = 7.98 Hz，4-H4)，7.06(d，7.98 Hz，4-H3) ,3.83(p，1-H7) ，3.22(m，4-H6) ，2.36(s，6-H1) ;13C-NMR (75MHz，CDCl3,301.2 K) : δ (ppm) = 200.0(8-C) ，170.9(13-C) ，140.5(2-C) ，137.2(9-C) ，132.8(12-C) ，131.5(3-C) ，131.0(5-C)，130.2(11-C) ，129.8(4-C) ，128.3(10-C) ，45.9(7-C) ，36.3(6-C) ，21.1(1-C) ;EA (C25H24O3S2) : 计算值: C: 68.78 H: 5.54 N: 0.00，测量值: C: 68.95 H: 5.47 N: 0.00;议员。: 摄氏137.5度至140.0度(计划4)。

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